企业邮箱
一竞技胃肠胶囊维持胚胎小白鼠小肠组织植块存活及重新组合成粘膜组织
[摘 要]：目的：通过体外检测一竞技胃肠胶囊（GIC）对胚胎小白鼠小肠器官型植块生长的作用以探索GIC修复粘膜损伤的机理。要领：体外作育胚胎小白鼠小肠器官型植块 ，并将所有植块分为两组：实验组和比照组。效果：实验组的小肠器官型植块能很好地维持存活 ，并有大宗的单个细胞、细胞克隆以及片状粘膜组织块长出 ，生长的时间长 ，生长状态好；而比照组的小肠器官型植块均很快归于殒命。二者差别极为显著。结论：GIC能够维持胚胎小白鼠小肠器官型植块的存活 ，并能增进细胞增殖 ，某种水平上维持组织的完整性 ，重新组合成粘膜组织 ，此效果可能与GIC激活上皮干细胞有关。
[要害词]：GIC；小肠植块；生长
GIC Could Maintain Survival and Promote Cell Growth of Organ-Type Explants of Intestine of Mouse Embryo Xu rong-xiang,Wang Yan-ping,Fan Ran,etc。
Central laboratory, MEBO Global Group 100053
[Abstract]： Objective: To research on the reparative mechanism of GIC on intestinal lesion through examining the effect of on the survival and cell growth of organ-type explants of intestinal tissue of mouse embryo. Methods: Cultured the organ-type explants of mouse intestinal tissue in vitro, all the explants were divided into two groups: test group and control group. Results: Explants could survive in test group. Single cells, cell clones and tissue pieces could grew out of the explants and grew long and well in test group. Conclusion: could maintain survival of intestinal explants and promote growth of cells from intestinal explants of mouse embryo and this process may be involved in the activation of epithelial stem cells.
[Key words]： GIC; intestinal explant ; growth
大宗临床实践显示 ，GIC可能也是通过激活粘膜上皮干细胞、增进组织细胞生长的机理实现对损伤粘膜修复的 ，为了证实这一看法 ，我们特设计了本实验。
一. 仪器、装备、质料、试剂及实验动物
作育箱（美国Forma）、冰箱（江苏长岭）、倒置显微镜（重庆光学仪器厂）、超等恒温水浴及恒温电烤箱（重庆四达）、超净事情台（北京半导体装备二厂）、显微成像剖析系统（上�？迫穑⑽⒉ü愣獹alanz）、微型盘算机（北京沐泽）、光学显微镜（江苏光学仪器厂）、种种型号注射器、12孔作育板（丹麦NUNC）、50ml离心管、Eppendorf离心管、微量加样器（1000μl、200μl、20μl、10μl, 均为法国Gilson）、巨细滴头、玻璃作育皿（φ5cm、φ6cm）、0.22μm微孔滤膜、针头滤器、显微外科器械、种种眼科手术器械、有盖三角烧瓶、有盖小试管、针头、GIC（一竞技公司生产）、MEM作育基（美国Hyclone）、胎牛血清（杭州三利）、青霉素和链霉素（华北制药）等。
实验动物：昆明种胚胎小白鼠
二. 实验要领：
1．取孕16日龄的昆明雌性小白鼠 ，颈椎脱臼法正法之 ，先置于75%乙醇中粗洗一遍（2分钟） ，再置于75%乙醇中消毒5分钟；
2．用眼科剪以及止血钳先剪开雌鼠的腹部皮肤 ，钝性疏散至两侧 ，充分袒露腹壁肌肉 ，然后小心剪开腹壁全层 ，切勿伤及内脏及小鼠胚胎；
3．剪开子宫 ，从宫腔中取出胚胎鼠 ，置入无菌平皿中；
4．用双抗-冷PBS将胚胎鼠体表洗涤两次 ，每次１分钟；
5．用显微外科铰剪将胚胎鼠的腹壁剪开 ，再用显微外科镊子夹起鼠近胃端小肠（包括十二指肠和空肠） ，截�。瞔m左右；
6．用双抗-冷PBS将胚胎鼠小肠一连洗涤两次 ，每次1分钟；
7．用显微外科铰剪将肠管纵行切开 ，充分袒露粘膜面；
8．用双抗-冷PBS将胚胎鼠小肠一连洗涤两次 ，每次1分钟；
9．将鼠小肠置于含双抗（青、链）的MEM作育液中冲洗2次 ，每次1分钟；
10．将鼠小肠剪成极小的器官型植块 ，巨细约1mm×1mm；
11．将植块置于12孔作育板的作育孔中央 ，每孔5块 ，距离约2mm ，结构合理 ，粘膜面向上 ，轻轻按压每块植块 ，使其紧贴作育板的外貌；
12．沿着作育孔的边沿 ，每孔中加入约0.5ml的完全MEM作育液 ，勿使作育液与植块接触；
13．将作育板置于37
，５％作育箱中预孵育１.5小时；
14．每孔加完全MEM作育液2ml ，轻拿轻放 ，切勿使植块飘起 ，实验组加GIC；
15．实验组和比照组同步等量换液 ，每次去掉原液的1/２左右, 再加入相同量的新鲜MEM作育液；
16．用倒置显微镜视察植块生长情形 ，用显微成像纪录剖析系统纪录所视察的效果 ，并用盘算机生涯图像。
三．实验效果
细胞作育110天内的报告效果：实验组和比照组的肠组织植块在作育之初 ，均能牢靠在作育孔中央 ，但随着作育时间的推移 ，植块逐渐脱离作育孔底部平面 ，游离飘浮于深层作育液中 ，悬浮的位置仍然靠近作育孔底部 ，但仍然集中于作育孔中央 ，少数位于周边 ，植块的巨细和形状险些没有转变 ，但在作育的第１０天左右 ，组织块就最先变得膨松 ，然后逐渐裂解为很小的组织块 ，并最终成为肉眼不易察觉的组织块 ，这时在视野中发明了单个细胞以及细胞克隆。在作育的第２０天 ，比照组中的细胞以及细胞克隆逐渐殒命 ，而实验组细胞依旧生长优异 ，单个细胞越来越多 ，在视野中随处可见 ，以位于中央部位的最多 ，细胞圆形 ，细胞核清晰。细胞呈典范活细胞状态。越向外越少 ，边沿险些没有 ，细胞克隆数也逐渐增多。每个克隆所含有的细胞个数随着时间的推移也越来越多。上述效果说明含15%胎牛血清的MEM作育基无法提供应组织块合适而富足的营养 ，而GIC作为高级细胞作育基能够提供应细胞合理而富足的营养 ，包管了组织和细胞的活性。
下面为作育历程中 ，实验组和比照组的比照图谱 ，可以深刻反应两组的差别。
|
图１ 作育第24天。图1A为比照组 ，图1B为实验组。比照组中的小肠组织细胞或细胞克隆已经殒命 ，实验组中显示的是大宗单个的小肠组织细胞 ，但其中没有克隆。
|
|
 |
 |
| 图2 作育第30天。图2A为比照组 ，图2B为实验组。比照组中为位于视野中央的大宗小肠组织细胞或细胞克隆已经殒命 ，实验组中显示的是即将形成克隆的细胞。 | |
 |
 |
|
图3 作育第38天。图3A为比照组 ，图3B为实验组。比照组中的小肠组织细胞或细胞克隆已经殒命 ，实验组中显示的是一块较为完整的小肠粘膜组织。
|
|
 |
 |
|
图4 作育第42天。图4A为比照组 ，图4B为实验组。比照组中的小肠组织细胞或细胞克隆已经殒命 ，实验组中显示的是一块小肠粘膜组织。
|
|
 |
 |
|
图5 作育第50天。图5A为比照组 ，图5B为实验组。比照组中的小肠组织细胞或细胞克隆已经殒命 ，实验组中显示的是两块小肠粘膜组织。
|
|
 |
 |
| 图6 作育第85天。图6A为比照组 ，图6B为实验组。比照组中的小肠组织细胞或细胞克隆已经殒命 ，实验组中显示的是一块小肠粘膜组织。 | |
 |
 |
|
图7 作育第90天。图7A为比照组 ，图7B为实验组。比照组中的小肠组织细胞或细胞克隆已经殒命 ，实验组中显示的是大宗的疏散生长的小肠组织细胞。
|
|
 |
 |
| 图8 作育第97天。图8A为比照组 ，图8B为实验组。比照组中的小肠组织细胞或细胞克隆已经殒命 ，实验组中显示的是一块由细胞毗连起来的片状结构。 | |
 |
 |
GIC可使离体肠粘膜细胞在作育液中重新毗连组合成粘膜组织
现在一样平常均接纳Trowell法举行体外小肠粘膜组织的器官型作育
，此法从人体或动物经口腔取材 ，取材部位为十二指肠远端和空肠近端 ，将取出的粘膜（不可能是纯粹的粘膜组织 ，应该还包括粘膜下层、肌层等等 ，这与我们的做法一致） ，将粘膜放在金属网格上 ，然后粘膜连同网格一起置于多孔作育板中央的孔 ，其它孔中置入无菌心理盐水浸泡过的无菌纱布以便坚持湿度 ，盖好 ，置入一个密闭容器中 ，通95%的氧气和5%的 ，37作育箱中作育。这是现在通用的要领。但此法有显着的弱点 ，即要领较为繁琐 ，取材量有限 ，一样平常每次不可多于10块活组织 ，多了容易引起胃肠道出血 ，取材量受到限制 ，我们现在接纳的要领对其举行了很大的简化 ，直接重新正法的胚胎动物体内获得无菌小肠粘膜组织 ，取材历程极容易控制量 ，也容易控制部位 ，特殊利便快捷。
由于体外作育现在还没有相宜的人工合成作育基 ，现有的报道体外作育的小肠粘膜组织维持存活时间较短 ，不管是用RPMI-1640作育基（附加葡萄糖、胰岛素、谷氨酰胺和胎牛血清） ，照旧用Trowell作育基（附加胎牛血清） ，细胞均最多存活24~48小时 ，之后就会泛起退化和殒命 ，一样平常很难凌驾48小时 ，作育基中若是不加血清 ，时间更短 ，6~12小时会退化坏死 ，由于植块存活时间短 ，给实验者提供的检测时间也很短 ，使多项目检测不可能 ，只能检测那些用药之后连忙就泛起的反应 ，恒久效应无法视察 ，使实验受到了很大限制。而在本实验中我们使用的含有GIC细胞高级作育基直接突破了现有作育基方面的限制 ，可以恒久作育离体肠粘膜组织 ，可以恒久在光镜下直接视察GIC对粘膜生长的影响。
本实验中 ，GIC对肠粘膜组织的细胞�；ぷ饔靡不竦昧讼宰盘逑�；关于作育历程中视察到的片状粘膜组织 ，之以是能保存良久时间 ，并且其内的细胞生长优异 ，是GIC对细胞外基质的正常代谢爆发了影响 ，细胞外基质是维系细胞相互毗连的基础。
为什么胃粘膜能够在这种情形中恒久生长呢？有两个缘故原由：一是GIC是营养富厚的细胞作育基及优异的细胞�；ぜ� ，另一个是肠道粘膜组织中有粘膜上皮干细胞 ，GIC启动了干细胞 ，使干细胞得以较长时间地生长。
关于第一个问题的诠释：
GIC有用因素中含有的亚油酸是细胞必需的脂肪酸 ，是组成细胞生物膜不可缺氨赡组分 ，是皮肤、粘膜及深层组织损伤后举行修复的主要质料；有用因素中含有的多种氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸、精氨酸、亮氨酸以及多种脂类物质、维生素、微量元素 ，为肠粘膜细胞的生长提供了富厚的营养；有用因素还具有抗病原微生物作用 ，对多种细菌、病毒、真菌、原生物都有较强的抑制作用 ，同时具有抗炎作用；药物中的有用因素还可以增进细胞的能量代谢 ，卵白质及核酸合成和生物膜转运等功效；缓慢释放 ，使细胞一连获得稳固的营养供应
。
GIC的抗氧化作用体现为抗自由基、稳固细胞膜。自由基是普遍保存于种种化学反应中的生动基团 ，倘若其爆发过量 ，从而引发所谓的自由基链式反应 ，则将导致细胞膜多不饱和脂肪酸的脂质过氧化 ，所爆发的大宗脂质过氧化物会损伤细胞膜及细胞内的大分子卵白质与核酸 ，对细胞造成损伤。有用因素中维生素E的抗自由基功效是由于其自身结构具有还原性 ，进而捕获自由基从而阻断自由基链式反应 ，起到对机体的�；ぷ饔� ，而其自身则经由维生素C和含硫氨基酸的再生而还原或转变为醌类化合物。大宗维生素E的保存可使细胞处于流动性高、通透性严密的状态。这除了可�；つど洗笞诘亩嗖槐ズ椭舅岵槐谎趸� ，还与其可以�；つぢ寻椎幕钚越峁褂泄�。
关于第二个问题的诠释：
肠道粘膜组织中有粘膜上皮干细胞 ，在合适条件下能够恒久生长 ，GIC有能力启动干细胞使之活化。肠道粘膜的上皮组织泉源于上皮干细胞（epithelial stem cell） ， 用
-胸腺嘧啶脱氧核苷（-TdR）标记放射自显影法视察瞬间标记后的肠腺细胞发明 ，上皮干细胞位于或靠近肠隐窝的部位
。为了维持动态平衡 ，这些干细胞一直转化为短暂滋生细胞并向中段移动 ，最后要么分解为具有吸收功效的刷状缘上皮细胞 ，要么分解为肠道内渗透细胞。分解后的细胞最后殒命并且从肠绒毛上脱落下来并进入肠腔 ，任何关细胞都具有生长滋生的能力 ，它们是一群分解较低的细胞 ，这是干细胞与分解细胞显着的差别 ，体外作育中最容易增殖的正常细胞是干细胞 ，干细胞属于未分解细胞 ，只管脱离了体内生长的微情形 ，但仍然具有较强的增殖能力�？梢远涎杂捎贕IC具有激活表皮干细胞的能力 ，对粘膜干细胞也应该有响应的激活能力。
至于生长的细胞的性子 ，我们以为一定是粘膜细胞 ，主要缘故原由有两个：一是由于上皮干细胞在体外有较强的增殖功效 ，这已经为许多研究效果所证实 ，肠壁其它细胞均不具备这种能力 ，本实验所用的标本中 ，除粘膜细胞外 ，数目最多的应该是肠壁的平滑肌细胞 ，平滑肌细胞在体外可举行有限的增殖 ，但不可恒久增殖。本实验完全可以扫除平滑肌细胞生长的可能性 ，由于作育自始至终未曾发明形态呈条形或梭形、排列呈束状的平滑肌细胞生长。再次 ，现在还没有发明平滑肌干细胞 ，这也是平滑肌在体外不易恒久生长的主要缘故原由。其它细胞如粘膜下层松散结缔组织中的动脉、静脉、淋巴管、神经纤维和粘膜下神经丛等组织的细胞能现在生长的可能性极小。第二个缘故原由是优势生长的问题 ，当某种细胞特殊容易生长的时间 ，其它细胞的生长就会受到一定水平的抑制或者完全被抑制 ，本实验中肠粘膜细胞在生长中占优势或绝对优势。
参 考 文 献
1. Trier J S. Organ culture of mucosa of human small intestine. Methods in cell biology, Academic Press Inc, 1980; Volume 21B, 365
2. 邹仲之 陈东 尹昕。消化管。在“组织学”。成令忠 主编。北京：人民卫生出书社 ，1981：1082
3. 郭燕世, 王玲, 王志均。油酸钠对消炎痛引起小鼠胃粘膜损伤的�；ぷ饔�。 北京医科大学学报 1987；3（9）：161
4. 杨素娟 ，郭燕世。油酸对消炎痛引起的胃粘膜损伤大鼠胃粘液渗透的影响。 心理学报 ，1985； 37（6）：532
5. 孙庆伟 ，滕敏昌 ，侯奕 ，等。江西医药 ， 1994；29（1）：1
6. Kiprono PC ， Kaberia F ， Keriko JM ，et al. The in vitro anti-fungal and anti-bacterial activities of beta-sitosterol from Senecio lyratus (Asteraceae). Z Naturforsch [C], 2000; 55(5): 485
7. MacDonald H B. Conjugated linoleic acid and disease prevention: a review of current knowledge. Journal of the American College of Nutrition, 2000;19(20):111s